博奥康（Biocan）生物科技有限公司主要为高校、生物研究所、医院以及生物医药公司提供基因编辑、基因干扰、病毒包装、蛋白表达、蛋白与基因表达检测与功能研究等多方面的技术服务。

一、分子生物学研究简介

（一）载体构建

       背景介绍

       目前市面上不同公司提供的表达载体骨架多达数百种，博奥康把大部分的真核表达载体骨架归纳为体系，能够满足客户的几乎所有需求。博奥康强大的元件库配合灵活的组合方式，可拼接出多种载体类型，囊括了市场上大部分原核和真核表达体系，能够在任何真核细胞中同时表达多种目的基因，可控地表达这些基因，可携带标记蛋白和抗药性基因。可为用户提供以下载体构建服务：

（二）基因检测

博奥康可以为客户提供以下基因检测服务：

1. qPCR检测

2. 甲基化检测

2.1甲基化特异性PCR（MS-PCR）

2.2 亚硫酸盐甲基化测序（Bisulfite Genomic Sequencing PCR）

3. SNP检测

3.1直接测序法

3.2 Taqman探针法（定量PCR）

4. ChIP检测

5. 单细胞凝胶电泳检测

6. 靶标荧光素酶报告基因检测

7. 

1. qPCR检测

² 背景介绍

 qRT-PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法，能够专一、灵敏、快速、高重复的精确定量起始模板的浓度，可用于miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA及DNA等分子定量检测。博奥康生物设计特异性引物通过SYBR green法或者Taqman法可检测微量样品的DNA\RNA表达水平。

² 服务内容：

RNA或者DNA的抽提与定量；引物设计及荧光定量PCR；数据分析；实验报告提交

² 优势：

（1）实时监测：通过扩增曲线能够实时监测PCR产物的积累。

（2）特异性强：实验完成后，溶解曲线的分析可以验证扩增产物的特异性，降低假阳性。

（3）精确定量：利用扩增进入指数增长期的CT值来定量测定起始模板量，从而实现了极为精确的核酸定量检测。

2 甲基化检测

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。博奥康生物提供以下方法检测甲基化：

2.1甲基化特异性PCR（MS-PCR）

2.2 亚硫酸盐甲基化测序（Bisulfite Genomic Sequencing PCR）

二、细胞生物学研究简介

（一）病毒包装

博奥康目前提供慢病毒、腺病毒、腺相关病毒以及杆状病毒表达系统，包括载体构建与病毒包装。您可以根据实验需要，选择合适的载体系统。

1慢病毒包装系统

2腺病毒包装系统

3腺相关病毒包装系统

4杆状病毒包装系统

1. 慢病毒包装系统

² 背景介绍

慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛，可以有效感染分裂期和静止期细胞，长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。

     博奥康的载体元件库可以为您提供包罗万象的载体元件，包括大家熟悉的广泛表达启动子，也包括丰富的组织特异性表达启动子、各种颜色荧光标记基因。

      2. 腺病毒包装系统

      背景介绍

      腺病毒是直径约80-120 nm的无包膜的线性双链DNA病毒，可迅速感染分裂和非分裂期细胞，与细胞表面受体结合后通过内吞作用进入细胞，在细胞核孔附近聚集，并在感染后2h将腺病毒的DNA释放到细胞核中并开始蛋白表达。

     系统优势：

1、宿主范围广-腺病毒可感染种类广泛的有丝分裂后期细胞；

2、包装容量大-包装容量可以达到6 kb；

3、病毒滴度高-病毒活性滴度达到10^11 PFU/mL。

    3. 腺相关病毒包装系统

² 背景介绍

腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）属于微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。AAV 的基因组约 4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的 2 个反向末端重复序列(ITR)之间。 由于腺相关病毒具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中，并且腺相关病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。

研究发现 AAV 具有多种血清型，各种不同血清型的 AAV 载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前博奥康生物在包装腺相关病毒时有 12种不同的 AAV 血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的 AAV 病毒。

4. 杆状病毒包装系统

² 背景介绍

杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核内复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣壳内，后者具有较大的柔韧性，可以容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究工作进展迅速。

系统优势：

1、外源基因克隆容量大：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段，目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限；

2、重组病毒易于筛选：重组了外源基因的Bacmid转染的昆虫细胞，可得到 100％阳性重组病毒；

3、具有完备的翻译后加工修饰系统：包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等；

4、高效表达外源基因的能力：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50%；

5、能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。

（二）稳转细胞株构建

      慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，因此，慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。

博奥康可提供的服务有：

过表达稳定细胞系构建

干扰稳定细胞系构建（shRNA敲低细胞系）

      背景介绍

      构建稳定细胞系是指将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，因此，慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。细胞转染常用物理方法（电转）、化学方法（脂质体等）、生物方法（病毒），根据不同的实验条件，选择最好的方法，来达到实验目的。

      应用

      （1）构建细胞模型，用于后续功能研究及基因治疗研究等；

      （2）用于药物靶筛选、细胞信号传导通路分析及蛋白质相互作用等。

      （三）细胞功能检测

²  背景介绍

细胞是生物体的基本结构单位，生物体内所有的生理功能和生化反应都是在细胞及其产物的物质基础上进行的。模拟动物体内的生理条件,将细胞在体外进行培养,使其不断的生长、繁殖，从而观察细胞的增殖、分化以及细胞衰老等过程的生命现象，进而对细胞功能进行各项检测，并对细胞信号通路蛋白进行表达分析及功能研究。

        博奥康提供的细胞功能检测服务有：

        细胞增殖（CCK8）

        细胞迁移

        细胞侵袭

        划痕实验

        细胞周期（流式检测）

        细胞凋亡（流式检测）

三、蛋白质研究简介

（一）重组蛋白原核表达

² 背景介绍

原核表达是一种将克隆化基因插入适当载体并导入大肠杆菌中以大量表达蛋白质的方法。这种技术在蛋白质纯化、定位和功能分析等领域具有广泛的应用。大肠杆菌作为一种原核生物，其特点是生长迅速且易于控制，同时使用的材料和成本相对较低。此外，还有许多不同类型的大肠杆菌菌株和与之相匹配的质粒可供选择。然而，在大肠杆菌中表达的蛋白质可能因为缺乏翻译后的修饰(如糖基化和磷酸化)而形成包涵体，这可能会影响蛋白质的活性和结构。

表达载体的在基因工程中起着至关重要的作用。原核表达载体通常是质粒，典型的特点包括选择标志的编码序列、可控转录的启动子、转录调控序列(如转录终止子和核糖体结合位点)以及多个限制酶切位点的接头。此外，还需要具有在宿主细胞内自主复制的序列。

² 工作流程

原核表达的一般流程包括以下几个步骤:获得目的基因、准备表达载体、将目的基因插入表达载体中并进行测序验证、转化表达宿主菌、诱导目标蛋白质的表达以及对表达蛋白质进行分析、提取和进一步检测。

² 服务内容

提供重组蛋白原核表达服务。我方是本课题的受托单位，双方须通力协作，共同完成本课题的研究任务。甲方负责提供实验设计及实施方案。

² 检测标准

采用SDS-PAGE 、WB的检测方法，验证目的蛋白表达纯化的结果可接受。

² 技术要求

（1）构建好原核表达载体，保证成功转化到高效表达的宿主菌；

（2）优化目的蛋白诱导表达条件，保证成功高效表达目的蛋白；

（3）制备及纯化目的蛋白，保证获得足量高纯度目的蛋白。

² 项目交付

（1）纯化后的目的蛋白；

（2）项目实施原始实验数据与实验报告；

（3）按双方约定期限交付。

² 对甲方提供的实验材料及资料的要求

（1）按照实验要求提供样本、基因信息及其相关文献资料；

（2）按要求邮寄实验样本。

² 服务费收取

具体鉴定费用以实验过程实际处理样品数乘以鉴定单价为准。

² 知识产权及保密条款

本实验所产生的任何实验数据（图、表等）、技术成果的知识产权归甲方所有。非甲方书面允许，乙方不得为本协议以外目的使用上述工作成果。除非双方另有约定，双方承诺，对本合同内容及本合同签订、履行过程中知悉的对方的商业秘密或其他重要信息予以保密，未经书面同意不得披露或不正当使用。

（二）蛋白检测

² 背景介绍

Western blot又叫蛋白免疫印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的-种实验方法，能对蛋白进行定性和半定量分析。

² 基本原理

混合蛋白质样品通过凝胶电泳分离后，将凝胶上的蛋白印迹转移到固相载体(NC膜或者PVDF膜)上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

² 应用

（1）基因在蛋白水平的表达;

（2）蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析。

（二）ELISA检测

² 背景介绍

酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术，由Eva Engvall和 Peter Perlmann 于1971年首次描述。该测定依赖于抗原-抗体相互作用的原理，并利用酶和比色检测来量化目标分子，主要用于检测和量化生物样品中特定蛋白质、肽、抗体或抗原的存在。ELISA测定通常应用于各个领域，包括临床诊断、药物研究和生命科学基础研究。

² 基本原理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种：

（1）直接ELISA：抗原通过一段时间的孵育被动地附着在塑料固相载体上，经过简单的洗涤后，通过添加与酶共价连接的抗体来检测抗原。孵育和洗涤后，通过添加色原/底物使酶活性产生颜色变化来显色。在规定的时间后通过化学手段终止酶活性后读取显色情况。在分光光度计中读取颜色。该方法相对简单，但它在灵敏度方面可能存在局限性，特别是当抗体-抗原相互作用相对较弱时。

（2）间接ELISA：间接ELISA是在直接ELISA的基础上添加酶标二抗进行检测。抗原通过孵育被动附着到孔上，洗涤后，将抗原特异性抗体（一抗）与抗原一起孵育。 清洗孔并通过添加与酶共价连接的抗物种抗体（二抗）来检测结合的抗体。二抗对于产生所添加的第一抗体的物种具有特异性。

（3）夹心ELISA：将捕获抗原的抗体（捕获抗体）附着在固相载体上，洗掉多余的未结合抗体后，添加抗原并被特异性捕获，通过直接ELISA或间接ELISA的形式检测抗原。这种组合进一步提高了检测的灵敏度和特异性，是最常见的ELISA实验形式。

² 应用

（1）检测生物样品中抗体、抗原、蛋白质和糖蛋白等物质的含量。

（2）药物药效学评价、筛选。